免疫組化實驗步驟及常見問題分析

免疫組化實驗流程
 
1.樣品制備
 
2.組織固定：根據要求收集人或動物的組織用于IHC分析，沖洗并用固定劑（一般用甲醛）進行固定
 
3.組織包埋：將經甲醛固定的組織嵌入石蠟，以長期保持其天然形狀和組織結構
 
4.切片安裝：將組織樣品在切片機上切片，并轉移至載玻片上干燥保持其形態
 
5.脫蠟水化：因切片上的石蠟會妨礙染色，所以需將切片上的石蠟溶出，并水化。脫蠟或水化不全容易造成非特異性背景著色（一般的脫蠟水化步驟是：將切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-無水乙醇5min-95%無水乙醇5min-90%無水乙醇5min-80%無水乙醇5min-70%無水乙醇5min-50%無水乙醇5min-蒸餾水5min×3，進行脫蠟水化）。
 
6.抗原修復：由于組織在甲醛固定過程中，蛋白之間發生了交聯及醛基的封閉從而掩蓋抗原決定簇。可以通過高壓加熱修復抗原，使細胞內抗原決定族暴露，從而提高抗原檢測率。
 
7.非特定位點封閉：為了防止一抗的非特異性結合造成假陽性，可以選用BSA、羊血清等封閉非特異性結合位點。封閉血清來源一般與二抗保持一致，室溫封閉10-30min。
 
8.樣品染色
 
一抗、二抗孵育：抗體孵育時間、溫度及濃度等因素對染色結果都存在很大影響。在4℃下反應緩慢，背景較淺；37℃反應較快時間較短；而室溫介于兩者之間，選擇室溫有利于實驗的進行。二抗一般室溫孵育30min。
 
底物顯色：基于與酶綴合的二抗，抗原通過生色或熒光方式直接檢測。
 
復染封片：組化染色后進行復染可以襯托出組織形態結構，常用的復染劑有蘇木精、曙紅、甲基綠、DAPI和Hoechst熒光染色。觀察結束后使用中性樹膠進行封片，可以長久保存。
 

免疫組化實驗常見問題分析

 
 
1. IHC實驗結果顯色過深
 
一抗濃度過高或孵育時間過長——降低一抗濃度或減少孵育時間
 
孵育溫度過高——選擇4℃或室溫孵育
 
2. 實驗結果存在非特異性顯色
 
石蠟切片脫蠟不夠——延長脫蠟時間
 
蛋白封閉不充分——增加蛋白封閉時間
 
組織富含內源性生物素與過氧化物酶——使用相關試劑進行封閉
 
3. 實驗結果顯色弱或無染色
 
一抗濃度過低或孵育時間過短——增加一抗濃度或延長孵育時間
 
組織中無目的抗原的表達：一抗種屬來源與二抗不匹配
 
免疫組化實驗注意事項
 
切片脫蠟和水化要充分，加反應液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，同時防止干片。
 
一抗的沖洗原則：單獨沖洗，防交叉反應污染；溫柔沖洗，防止切片脫落；可采用浸洗方式。
 

有條件的話立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。

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