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評估ELISA實驗數據指標有哪些?

更新時間:2023-08-09點擊次數:1659

ELISA實驗常用于檢測和定量復雜混合物中的特定蛋白質。結果出來后,就需要一定的方法來評估數據是否可靠。主要從以下幾個方面進行評估:檢測內精度,稀釋線性度,回收率,靈敏度(檢測限)等。

檢測內精度

檢測內精度:一般是檢測孔板間的重復性。一般用變異系數CV值來評估,變異系數(CV)為標準差σ與平均數µ的比值。每個樣品的 %CV 通常應小于 10%,%CV越大代表孔間差異大,重復性不好,結果不可信。

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注:CV較大可由以下原因引起: 移液不準確;在使用前確保槍頭在移液器上套牢,確保吸取正確的液體量;試劑濺入其他孔中;樣本或試劑受細菌或真菌污染;試劑間交叉污染;酶標板各處溫度不一致,確保酶標板在遠離氣流的恒溫環境中孵育;部分孔干透,確保酶標板在孵育過程中始終處于被封蓋狀態。

稀釋線性度

稀釋線性度:稀釋線性度是指不同稀釋水平下測試樣品的結果精度。不同稀釋倍數下的測量值與精確值的比值應該在70%-130%之間。

在沒有基質干擾時,無論如何稀釋,測量值都和真實值吻合。而有基質干擾時,樣品稀釋會導致基質被稀釋,會造成非特異性結合比例的減少,測量值也會隨稀釋倍數的改變而改變。

回收率

回收率:回收率用于確定目標物質檢測是否受樣品基質差異的影響。例如,待測上清液中所含的大量蛋白質可能會阻礙抗體結合,提高信噪比,從而導致目標物質檢測的濃度低于實際值。通過將已知濃度的目標物質加入到不同的樣品基質中來確定回收率。如果平均回收率為 80%-120%,則認為樣品基質對檢測準確定量分析物的能力影響最小。回收率=用基質稀釋的目標物質的檢測值/用基質稀釋的目標物質的確定值*100%。

回收率過高或是過低,則提示實驗體系受到較大的復雜基質干擾。比如在空白血清中摻入了 1000 pg/mL 的 IL-2,回收率只有 50%,提示血清中有干擾因素影響了抗體與 IL-2 分子的結合。

靈敏度(檢測限)

靈敏度(檢測限):靈敏度指可與背景區分的低分析物水平,通常稱為分析靈敏度或檢測限。一般有三個指標,分別為LOB,LOD,LOQ。

LOB(Limit of blank), 就是我們通常講的空白檢測限。LOB指的是用空白樣本去測試,在一定的概率下能測得的最高測量結果。

LOD(Limit of detection), 就是我們通常講的檢測限,就不是用空白樣本去檢測了,是對低濃度的分析物樣本進行測試,在一定的概率的條件下能測得的低值。

LOQ(Limit of quantitation), 就是我們通常講的定量限,這個也是用低濃度的分析物樣本進行測試得出的較低的值,這個值的準確性是有要求的,就是不光要能測到,而且還要保證結果是準確的。

打個比方:比如遠處一個物體,隨著距離的縮短,你的眼睛從看不見(空白檢測限)到能看見(檢測限),最后到能確認是什么物體(定量限)。

信噪比

信噪比(Signal/Noise, S/N)就是信號與噪音的比值,也就是樣品數據與空白數據的比值。一般以信噪比為 3 : 1 時相應濃度或量確定檢測限, 10:1時的量為定量限。

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